Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
СТБ (раствор хлорида натрия в трис-буфере). 8,0 г натрия хлорида R и 0,6 г трис-(гидроксиметил)-аминометана R растворяют в воде R. Доводят значение рН до 7,2 (2.2.3) с помощью 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.
Раствор папаина. Раствор готовят перемешиванием при 370С в течение 30 минут 1 г папаина R в 10 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора рН 5,4 R, центрифугированием при 10000 g в течение 5 минут и фильтрованием через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл фильтрата, 1 мл раствора L-цистеина R концентрацией 48,44 г/л и 1 мл раствора натрия эдетата R концентрацией 3,72 г/л и разбавляют до 10 мл 0,067 М фосфатным буферным раствором рН 5,4 R. Аликвоты замораживают при температуре -200С и ниже.
Эритроциты. Используют пул D-положительных эритроцитов, полученных не менее чем из трех групп доноров с группой 0 R1R1. Клетки промывают четырежды СФБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 минут, смешивают подходящий объем предварительно нагретых упакованных клеток с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (объемное соотношение 2:1 было найдено подходящим) и инкубируют при 370С в течение 10 минут. Клетки промывают четырежды СФБ. Хранят при 40С с подходящим стабилизатором не более недели.
Биотинированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкциями.
Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой. Предпочтительно использовать модифицированный реагент, сочетающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания. Используют в соответствии с инструкциями.
Раствор субстрата. Используют в соответствии с инструкциями пара-нитрофенилфосфат.
Буфер для фиксации клеток. 18,02 г глюкозы R, 4,09 г натрия хлорида R, 1,24 г борной кислоты R, 10,29 г натрия цитрата R и 0,74 г натрия эдетата R растворяют в воде R. Доводят показатель рН (2.2.3) до 7,2-7,3 добавлением 1 М раствора натрия гидроксида или 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют водой R до 1000 мл. Хранят при температуре 40С. Используют непосредственно из места хранения.
Раствор глутарового альдегида. Непосредственно перед применением 90 мкл раствора глутарового альдегида R концентрацией 250 г/л добавляют к 24 мл холодного СФБ.
Титрационные микропланшеты. Планшеты, предназначенные для покрытия эритроцитами, представляют собой плоскодонные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуноферментного анализа и с большой емкостью в отношении связывания с белками. Планшеты, используемые для приготовления разведений иммуноглобулина, представляют собой планшеты из полистирола или поливинилхлорида с U- или V-образными формами ячеек.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Готовят 0,1% (по объему) суспензию обработанных папаином эритроцитов в холодном буфере для фиксации клеток. В каждую ячейку плоскодонного титрационного микропланшета помешают по 50 мкл суспензии.
Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 минут, предпочтительно, при 40С. Не удаляя супернатант, к содержимому каждой из ячеек осторожно добавляют по 100 мкл раствора глутарового альдегида и выдерживают в течение 10 минут. Содержимое ячеек сливают путем быстрого переворачивания планшета и трижды промывают каждую ячейку 250-300 мкл СФБ. Эта операция может производиться либо вручную, либо с использованием автоматического устройства для промывания планшетов. Планшет либо используют в нижеописанном испытании, либо после сливания СФБ, добавления в каждую ячейку 100 мкл буфера для фиксации клеток и запечатывания пластиковой пленкой хранят при 40С не более 1 месяца.
Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью
получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.
Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R.
В ячейки каждого из рядов титрационного микропланшета с U- или V-образными формами ячеек вносят по 35 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения. К содержимому каждой из ячеек добавляют по 35 мкл биотинированного Brad-5 с содержанием 250 нг/мл.
Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем. Добавляют по 250 мкл СФБ, содержащего 20 г/л бычьего альбумина R и оставляют при комнатной температуре на 30 минут.
Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем и помещают в каждую из ячеек по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора и раствора сравнения, содержащих биотинированный Brad-5. 50 мкл СФБ, содержащего 10 г/л бычьего альбумина R, используют в качестве отрицательного контроля. Планшет запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
